Lumafuor熒光微球逆行示蹤劑中文使用說明

Lumafluor公司的RetroBeads™是用于逆行示蹤的熒光微球，并且是被大量文獻(xiàn)證明有效的微球。數(shù)百篇已發(fā)表的論文證明Lumafluor的Retrobeads™逆行示蹤熒光微球在無脊椎動(dòng)物到靈長類動(dòng)物以及所有介于兩者之間的系統(tǒng)中是有效的。

Lumafluor Retrobeads™產(chǎn)品特點(diǎn)：

1)高度受限的注射-非常適合進(jìn)行詳細(xì)的連通性研究。

2)在活細(xì)胞中無限期（> 1年！），無毒。

3)與大多數(shù)其他順行示蹤劑，原位雜交和免疫組織化學(xué)兼容。

產(chǎn)品訂購：

Lumafuor熒光微球逆行示蹤劑中文使用說明

產(chǎn)品形態(tài)： 隨附的小瓶包含懸浮在蒸餾水中的濃縮珠溶液。如果紅珠用于逆行追蹤神經(jīng)元通路，則溶液可以按原樣使用或稀釋使用。在大鼠視覺皮層中，使用紅珠時(shí)，1:4 的稀釋度似乎不會(huì)降低逆行標(biāo)記的質(zhì)量或程度。但是，對于初始實(shí)驗(yàn)，我們強(qiáng)烈建議使用溶液全強(qiáng)度。除蒸餾水外，標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（NaCl、KCl）也可用作稀釋劑。所提供的綠色微球，可以直接用于逆行追蹤實(shí)驗(yàn)。不建議稀釋綠色微球。

產(chǎn)品儲(chǔ)存：珠溶液應(yīng)儲(chǔ)存在加濕容器中，在冰箱中，以防止蒸發(fā)。不要凍結(jié)！被凍結(jié)的珠子將無法工作，也無法挽救。如果珠子變干，它們就不能被重組。這種材料的保質(zhì)期尚未確定，但如果儲(chǔ)存得當(dāng)，它可以保持幾年的良好狀態(tài)。

產(chǎn)品應(yīng)用：最好使用壓力注射珠子（例如 1 毫升 Hamilton 注射器或加壓空氣注射系統(tǒng)）。對于局部電路工作，已通過具有 30-50 um 直徑的玻璃移液器注入非常少量 (30-50 nl)。對于常規(guī)逆行追蹤，使用更大體積 (0.1-0.3 ul) 和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會(huì)擴(kuò)散到遠(yuǎn)離注射部位的地方（通常小于 1 毫米）。因此，為了標(biāo)記投射到大型結(jié)構(gòu)的所有或大部分神經(jīng)元，應(yīng)該進(jìn)行幾次注射。不建議將珠子的離子電滲應(yīng)用作為傳遞示蹤劑的有效方法。然而，珠子確實(shí)帶有凈負(fù)電荷。

生存時(shí)間：在大多數(shù)溫血脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中，注射后的最短有效生存時(shí)間約為 24 小時(shí)。標(biāo)記強(qiáng)度隨著存活時(shí)間的延長而增加，最長可達(dá) 48 小時(shí)。48 小時(shí)后，未觀察到標(biāo)記強(qiáng)度增加（或減少）。這些值在冷血?jiǎng)游镏锌赡苡泻艽蟛煌ㄗh初始生存時(shí)間為一周。最長存活時(shí)間尚未確定，但即使在 14 個(gè)月的存活時(shí)間后，標(biāo)簽的質(zhì)量或范圍也沒有變化。單元格可能被標(biāo)記。未觀察到對動(dòng)物或神經(jīng)元的毒性作用。

固定和處理：標(biāo)準(zhǔn)固定是用 0.1 M 磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在 0.1 M 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中加入 4% 多聚甲醛。戊二醛會(huì)產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，這可能會(huì)掩蓋珠標(biāo)記的神經(jīng)元，應(yīng)盡可能避免。綠色珠子在戊二醛固定材料中將看不見。將冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，安裝在涂有明膠的載玻片上，然后風(fēng)干。干燥后，可以將載玻片在二甲苯中清洗 1 分鐘，然后用 Fluoromount 或 Krystalon 蓋上蓋子。Fluoromount 購自 Atomergic Chemetals Corp., Farmingdale, NY；來自新澤西州吉布斯敦的 Harleco (EM Industries) 的 Krystalon。

短暫接觸酒精和二甲苯無害，但長時(shí)間接觸（超過 5 分鐘）會(huì)破壞珠子。珠子對甘油非常敏感，如果安裝在含甘油的溶液中會(huì)迅速褪色。在需要使用非透明/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果將載玻片保存在黑暗中，細(xì)胞中的標(biāo)記至少一年不會(huì)褪色（盡管背景自發(fā)熒光可能會(huì)顯著增加）。到目前為止，在塑料嵌入后保留珠子標(biāo)記的嘗試尚未成功。

觀察：紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何用于羅丹明的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組會(huì)產(chǎn)生非常高的背景，這會(huì)使標(biāo)記的細(xì)胞不可見。使用 Zeiss 和 Leitz 標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片都獲得了良好的結(jié)果。對于綠色珠子，寬帶熒光素過濾器效果很好。路西法黃的濾光片組提供更強(qiáng)烈的信號，但以更高的背景為代價(jià)。窄帶熒光素濾光片會(huì)產(chǎn)生比寬帶濾光片弱得多的信號。 即使經(jīng)過長時(shí)間的觀察或顯微攝影，珠子也不會(huì)明顯褪色。

使用低功率、低數(shù)值孔徑的干式物鏡（例如 X4、X10）通?？床坏綐?biāo)記。如果細(xì)胞被強(qiáng)烈標(biāo)記，X10 浸沒物鏡（數(shù)值孔徑為 0.4 或更大）或更高功率的干物鏡通常會(huì)顯示細(xì)胞。然而，X25 浸沒物鏡通常會(huì)顯示非常清晰標(biāo)記的細(xì)胞，而低功率物鏡會(huì)錯(cuò)過這些細(xì)胞。這些警告尤其適用于綠珠。在決定實(shí)驗(yàn)不起作用之前，請使用浸入物鏡檢查注射部位附近的部分。應(yīng)該存在許多局部標(biāo)記的細(xì)胞。

綠珠使用者的附加信息：在迄今為止所做的工作中，似乎年輕的動(dòng)物比年長的動(dòng)物更好地傳遞標(biāo)簽。此外，年輕動(dòng)物的組織自發(fā)熒光較低。因此，如果可能的話，建議在涉及綠珠的實(shí)驗(yàn)中使用年輕的動(dòng)物。因?yàn)榫G色珠子在比紅色珠子更短的波長下被激發(fā)，所以組織自發(fā)熒光是一個(gè)更大的問題。因此，盡量減少自發(fā)熒光將產(chǎn)生更好的對比度信號。減少自發(fā)熒光的方法包括：

1) 使用更薄的切片（例如 30 um 而不是 40 或 50）

2) 使用較年輕的動(dòng)物

3) 在蓋玻片后立即檢查切片（背景隨著時(shí)間的推移而增加）